鸡透明质酸检测试剂盒的使用步骤和方法

　　鸡透明质酸检测试剂盒的使用步骤和方法：

　　一、样品DNA的制备

　　用自选方法提取待测样品的总DNA。注意：待测样品的DNA纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品DNA，后面的PCR再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。

　　二、制备TB基因标准曲线

　　（以10-10E6这36045个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或鸡透明质酸检测试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

　　1.标记36045个离心管，分别为6，5，4，3，2和1号。

　　2.用带芯枪头分别加入45μL超纯水（建议用带芯枪头，下同）。

　　3.先将鸡透明质酸检测试剂盒提供的阳性对照用超纯水10倍梯度稀释到10E7拷贝/μL（注：请不要将鸡透明质酸检测试剂盒提供的标准品一次性稀释至10E7拷贝/μL，建议每次稀释10倍剃度稀释，梯度稀释至10E7拷贝/μL）。

　　4.在6号管中加入5μL10E7拷贝/μL的TB阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10E6拷贝/μL的TB阳性对照。

　　5.换枪头，从6号管中取5μL溶液到5号管中，充分震荡1分钟，得10E5拷贝/μL的TB阳性对照。

　　6.换枪头，从5号管中取5μL溶液到4号管中，得10E4拷贝/μL的TB阳性对照。

　　7.重复上面的操作直到得到从10E6拷贝/μL到10E1拷贝/μL36045个稀释度的TB阳性对照。

　　8.NC管中不加任何阳性对照。

　　9.从1-6号管中分别取5μL和待测样品一起进行定量PCR（见下步），每个样品做3次重复。PCR后得到每个阳性对照稀释样品的荧光PCRCt值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。